沒(méi)有液氮罐如何凍存細(xì)胞?不用液氮罐，在冰箱如何凍存4度/-20度/-70度各放多久啊?

　　如果不用液氮罐，可以用-70。我們是這樣做的，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至凍存管中，在-20放置半小時(shí)到一小時(shí)左右，預(yù)凍。之后放入-70中，我們嘗試過(guò)載-70中放置1年的細(xì)胞沒(méi)有問(wèn)題，復(fù)蘇之后狀態(tài)尚佳。至于更長(zhǎng)時(shí)間我們沒(méi)有嘗試過(guò)，但是老板說(shuō)1年半沒(méi)問(wèn)題，在國(guó)外他試過(guò)。

　　細(xì)胞凍遵循：慢凍速溶的原則。

　　還可以拿毛巾包著凍存管就可以直接放進(jìn)-70，即可以遵循細(xì)胞凍慢凍速溶的原則，又比較方便，不用先放-20，因?yàn)槭锹齼鲞M(jìn)去的，所以能更好的達(dá)到梯度凍存。

　　實(shí)際上，我認(rèn)為慢凍速溶原則是正確的。

　　慢凍是要給DMSO以滲透入細(xì)胞的時(shí)間，所以我的經(jīng)驗(yàn)是4度的半小時(shí)要保證，之后就基本上可以馬上凍起來(lái)也沒(méi)有什么關(guān)系了。

　　毛巾包裹法十分新穎，呵呵。不過(guò)，從原理上看，確實(shí)是值得嘗試的好方法，既保證了時(shí)間，又省去了搬來(lái)搬去的麻煩。

　　至于-80度的保存時(shí)間，我親眼所見(jiàn)，半年絕對(duì)沒(méi)有問(wèn)題。

　　在4度的情況下，要看你是什么細(xì)胞了，如果是老鼠的細(xì)胞可以放1小時(shí)左右，其他細(xì)胞最多半小時(shí)(本人做過(guò)試驗(yàn)的);在-20度的情況下，老鼠的可以放1天左右，其他細(xì)胞半天，但其狀態(tài)不是很好了;在-70度的情況下，老鼠的細(xì)胞可以放1到2年，在此期間要復(fù)蘇一次看其生長(zhǎng)情況，其他細(xì)胞最多一年了!

　　1. 選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，在收集細(xì)胞24小時(shí)前換液一次。

　　2. 用常規(guī)方法將細(xì)胞消化下來(lái)，按(1～5)×106/ml濃度、懸浮于含有10% DMSO的小牛血清或生長(zhǎng)液中。凍存的細(xì)胞數(shù)量要充分，因復(fù)蘇時(shí)接種的細(xì)胞數(shù)量應(yīng)比平常多一些。

　　3. 用吸管吸取細(xì)胞懸液，分裝于無(wú)菌安培管中(沒(méi)管1ml)，嚴(yán)密封口，放入三層紗布小袋，注明細(xì)胞名稱和凍存時(shí)間，便于以后查找。

　　4. 凍存 當(dāng)前已有專用細(xì)胞凍存器，能精確地控制凍存溫度。在無(wú)凍存器的情況下，可用手工方法。從把安培懸液在液氮容器口開(kāi)始，在30～40min內(nèi)，下降到液氮表面，在停30min后，直接投入液氮中?；蛳葘才嘁迫胍旱蘅陬i部氣相中過(guò)夜，次日將紗布袋緩慢下降至液氮中，歷時(shí)3分鐘。在液氮中可長(zhǎng)期保存。 若沒(méi)有液氮，可存于-80冰箱內(nèi)，不過(guò)注意保存時(shí)間，比液氮短，可保存3個(gè)月左右。